NC|赵永娟教授等发现构象特异性纳米抗体——靶向烟酰胺单核苷酸激活状态SARM1

摘要
2022年12月9日，香港中文大学（深圳）医学院赵永娟团队及其合作者在Nature Communications（自然-通讯）杂志发表题为A conformation-specific nanobody targeting the nicotinamide mononucleotide-activated state of SARM1（一种靶向 SARM1 烟酰胺单核苷酸激活状态的构象特异性纳米体）的研究论文。研究人员利用康体生命抗体发现平台，用SARM1蛋白免疫羊驼并建立噬菌体库，通过噬菌体展示技术筛选出能够与SARM1激活状态构象特异结合的纳米抗体Nb-C6。SARM1的激活可导致细胞钙离子水平升高，与多途径诱导的周围神经病变有关。了解 SARM1的激活机制具有重要意义，Nb-C6能够特异结合并稳定激活状态的SARM1，Nb-C6帮助研究者探究了SARM1在激活过程中的结构变化，并可以对细胞中的活性 SARM1 进行成像和定位，提供了在活细胞中操纵 SARM1 的方法。

前言

正文
研究人员为了了解 SARM1激活状态的结构，采取了利用纳米抗体(Nb)稳定SARM1活性形式结构的方法。研究人员用重组的SARM1与弗氏佐剂混合免疫羊驼。经过6轮免疫后，从外周淋巴细胞提取mRNA，并在此基础上构建了纳米抗体文库（图1），利用噬菌体展示技术筛选到了多条能与SARM1结合的阳性克隆。其中，Nb-C6能够特异识别 NMN 激活的 SARM1。 

图1 Nb-C6的研发流程

研究人员用表面等离子体共振（SPR）技术测试了在不同浓度配体溶液中Nb-C6与SARM1的结合情况，在高 NAD 浓度（1.6 mM）下，Nb-C6 与 SARM1 的结合非常低。随着配体浓度转变至100 µM NMN，Nb-C6与 SARM1的结合比例增加到了60%以上，其线性拟合图和结合示意图如图2所示，表明 NAD / NMN 比率决定了 Nb - C6与SARM1的结合，Nb-C6能够特异结合NMN激活状态下的SARM1。

                                                                                                                  图2 Nb-C6指示并促进SARM1的激活

研究人员进一步测试了与mNeonGreen (mNG，一种荧光标记蛋白)融合表达的Nb-C6可视化检测细胞中激活形式的SARM1的能力。表达了SARM1 的HEK 293 细胞用CZ-48（能够穿透细胞膜的NMN类似物）处理，成像结果表明，Nb-C6的结合在 CZ-48 激活 SARM1 后显著增加，证实了其构象特异性并表明线粒体定位的 SARM1 的激活经历了构象变化。此外，作者还发现Nb-C6单独在体外可以激活SARM1，但与NMN和两者一起激活相比效果明显较弱。他们还证明，在内源表达和诱导表达SARM1的两种HEK 293细胞中过度表达Nb-C6（C6-YFP）导致cADPR水平升高，表明内源性和诱导性SARM1分别被激活。在过度表达不相关Nb的对照细胞中没有观察到cADPR的增加。上述结果充分验证了 Nb-C6 仅识别 SARM1 的激活形式，最低限度地识别非活性形式，表明 Nb-C6 是激活活细胞内源性和外源性 SARM1 的有价值的工具。

图3 (a) Nb-C6 对 CZ-48 激活的 SARM1 进行染色，表达SARM1的 HEK293 细胞用 1 μg/mL 多西环素处理 12 小时，然后用 100 μM CZ-48 处理 6 小时，固定细胞并分别用 C6-mNeonGreen、抗 SARM1多克隆抗体、线粒体染料Tom20染色。水平比例尺：5 μm；（b）Nb-C6 染色和抗 SARM1 染色信号的比率。

为深入了解SARM1的激活机制，研究人员通过冷冻电子显微镜获得了SARM1NMN/Nb-C6 复合物的结构（分别率：2.7 Å），复合物含两层八聚环，包含16个SARM1和16个Nb-C6。Nb-C6 主要与 SAM 结构域结合并在 C 末端二聚化，稳定整个结构。SARM1NMN 的整体结构呈“盛开的莲花”形状（图 3a-c），与 SARM1NAD 紧凑的“甜甜圈”结构（图4）形成鲜明对比。 相较于SARM1NAD， ARM-TIR 域作为一个整体从 SAM 域摆动并旋转~139°。NMN 结合暴露区域后，SARM1 的这种大构象变化被 Nb-C6 识别，说明其仅对 NMN 激活的 SARM1 具有特异性。

图4活化和非活化状态下 SARM1 的冷冻电镜结构。a–c SARM1NMN/Nb-C6 复合物的结构，（a）顶视图； (b) 底视图；(c) 侧视图; SARM1 和 Nb-C6 显示为表面模型，ARM 域为绿色，TIR 域为品红色，SAM 域为黄色，Nb-C6 为灰色，NMN 显示为红色球体。d-f SARM1NAD (PDB 7ANW) 的整体结构。 （d） 顶视图； （e） 底视图； （f） 侧视图；SARM1 显示为表面模型，ARM 域为蓝色，TIR 域为小麦色，SAM 域为黄色，NAD 显示为红色的球体模型。(g) NMN 和 NAD 结合的 SARM1 叠加的侧视图。为清楚起见，只有一个 NMN 结合和 NAD 结合形式的SARM1显示为卡通模型，其他结构被淡化，SARM1NMN 复合物中的 Nb-C6 被隐藏。SARM1NMN 的颜色与图(a–c) 中一样，SARM1NAD 的颜色与图 (d–f) 中一样；ARM 域中的残基 E60 和 Q81 以及 TIR 域中的 E686 显示为球体；相应残基的重新定向由黑色箭头指示。

研究人员通过分析结构数据，深入的解析了NMN诱导的SARM1激活机制，发现NMN 结合位点与 NAD 的结合位点相同，并通过ARMNMN 和 ARMNAD 之间的结构差异解释了为何NMN 是激活剂而 NAD 是抑制剂。NMN/NAD 结合位点处的突变可以消除神经元中SARM1对烟酰胺核糖诱导的NMN 积累的反应。作者还发现ARM 域的向内弯曲对于 NMN 诱导的 SARM1 激活是必要的。接下来，作者研究了 NMN 诱导的 ARM 弯曲如何导致其从 SAM 域解离，并发现纳米抗体主要与 SAM 域结合，较小程度上与 ARM-SAM 连接子结合。Nb-C6 和 SAM 域之间的结合界面在很大程度上与ARM:SAM 界面重叠（图 5），这说明 Nb-C6 无法识别非活性 SARM1，因为结合位点被 ARM 遮盖了。

HDX-MS （氢氘交换质谱）和 XL-MS（交联质谱） 数据表明 NMN 激活的 SARM1 在溶液中经历了一系列 ARM 和 TIR 结构域重排。因此，Nb-C6 稳定结构可能代表这种最终激活状态的中间体。如图 6 所示，在这个最终状态下，TIR 域从 ARM 脱离并直接与相邻的 TIR 相互作用，形成多聚体并导致酶促活动。这种构象变化与 ARM 结构域重排相结合，有助于 SARM1 外围环的分解。

                                                                                     图6 SARM1在非激活和激活状态间的转换模型

小结
SARM1 因其在轴突退变（AxD）中的作用而受到关注。SARM1 是 NADase 和自我调节信号酶，可生成 cADPR 和 NAADP。SARM1 的激活是由细胞内 NAD 的减少引起的，可在诸如紫杉醇诱导的周围神经病变情况下发生； NMN也可激活 SARM1。研究人员发现了一种构象特异性纳米抗体Nb-C6，通过多种实验证明了Nb-C6仅稳定并结合激活状态的 SARM1，并利用Nb-C6实现了活细胞中激活状态的SARM1的成像与定位。Nb-C6帮助作者获得了SARM1在激活状态的冷冻电镜结构，联合HDX-MS 和 XL-MS 方法，深入解析了SARM1的激活机制。纳米抗体相较于传统抗体有更优秀的理化性质，在生物学和医学领域有诸多应用。 康体生命提供一站式纳米抗体发现服务，欢迎咨询与交流！